Lieu : CGFB
Soutenance en français
Maxime Malivert
IINS
Équipe : Bordeaux Imaging Center – Photonic unit
Thèse dirigée par : Daniel Choquet
Titre
Intégration de l’optique adaptative sur un microscope à feuille de lumière « lattice » pour l’imagerie super-résolue en profondeur.
Résumé
La microscopie de fluorescence est devenue un outil indispensable pour les études biologiques en permettant d’observer des structures d’intérêts de manière spécifique et contrastée au sein d’échantillons fixés ou vivant. Parmi ces techniques, le sectionnement optique offert par la microscopie à feuille de lumière jouit d’un grand avantage en minimisant le bruit de fond et en réduisant phototoxicité/photoblanchiment. La microscopie à feuille de lumière « lattice » (LLSM) maximise ses caractéristiques en utilisant une feuille de lumière, d’épaisseur constante sur un plus grand champ de vue. Ainsi, elle offre la possibilité d’imager la fluorescence à l’intérieur d’échantillons épais jusqu’à environ 30 μm, avec une très grande résolution spatiale, temporelle et une très faible phototoxicité.
Toutefois, comme d’autres techniques de microscopie, elle souffre de deux problématiques liées à la nature de la lumière, qui dégradent la qualité des images acquises. (1) Les aberrations optiques, induites par les interfaces et l’inhomogénéité des échantillons, croissantes avec la profondeur d’imagerie, perturbent le front d’onde et donc la résolution finale de l’image. (2) La limite de diffraction contraint la résolution à ~200 nm minimum et empêche donc l’observation de structures de taille inférieure à cette limite. Pour contrer ces phénomènes, nous avons décidé de combiner la LLSM avec deux méthodes complémentaires : (1) l’optique adaptative pour minimiser les aberrations optiques en profondeur d’échantillons épais et (2) la microscopie à super-résolution à travers une technique de microscopie par localisation de molécules uniques (SMLM), nommée DNA-PAINT, pour atteindre des résolutions nanométriques. Plus particulièrement, notre méthode, nommée AIO, s’appuie sur les images enregistrées par la caméra, à travers : une refocalisation de la feuille de lumière (AF) et une correction par mesure indirecte du front d’onde, nommée (3N+). Cette méthode, dont le paramétrage a été étudié au cours de cette thèse, améliore la résolution et le contraste des images en résolution limitée par diffraction et en SMLM. (1) En résolution « classique », l’AIO permet de récupérer un front d’onde plan avec une erreur inférieure à 50 nm RMS et en moins de 40 secondes. La correction des aberrations optimise également le processus de déconvolution en restaurant la PSF du système. Ce gain est illustré à travers l’imagerie d’épines dendritiques à 40 μm sous la surface de tranche de cerveaux organotypiques et l’acquisition de structures sub-micrométrique dans la deuxième couche cellulaire de racines d’Arabidopsis. (2) En super-résolution, nous avons démontré l’application d’un protocole DNA-PAINT jusqu’à ~50 μm sous la surface de tranches de cerveaux et l’intérêt de l’optique adaptative pour améliorer la densité de détection et la précision de localisation en reconstruction SMLM.
Mots-clés
Microscopie à feuille de lumière « lattice » (LLSM), Optique adaptative, Microscopie à super-résolution, Microscopie par localisation de molécules uniques (SMLM).
Publication
Jury
Mme Fragola Alexandra, professeur des Universités, Université Paris-Saclay – Rapportrice
Mme Danglot Lydia, CR INSERM, Directrice Scientifique de Neurimag, IPNP – Rapportrice
Mr Choquet Daniel, DR CNRS, IINS, Examinateur
Mme Bayer Emmanuelle, DR CNRS, LMB, Examinateur
Mr Colombelli Julien, Directeur Plateforme Imagerie, IRB Barcelona, Examinateur
Mr Galland Rémi, CR CNRS, IINS, Invité
Mr Harms Fabrice, Responsable Scientifique, Imagine Optic, Invité