Lieu : CARF
IMN
Equipe : Neuropathologie intégrative des α-Synucleinopathies
Thèse dirigée par Florent Laferrière
Titre
Amyloïdes cérébraux d’alpha-synucléine dans les synucléinopathies : quantification, bioactivité, et propriété de souches
Abstract
La présence d’inclusions protéiques composées majoritairement d’alpha-synucléine (a-syn), une protéine naturellement présente dans le cerveau, est la principale caractéristique des synucléinopathies, un ensemble de maladies neurodégénératives. Celles-ci regroupent l’atrophie multisystématisée (MSA), la maladie de Parkinson (PD), ainsi que la démence à corps de Lewy. L’a-syn présente dans les corps d’inclusions est retrouvée sous forme de fibres amyloïdes. A l’instar des maladies à prions, il est maintenant généralement admis que les synucléinopathies représentent des souches distinctes d’a-syn. Les bases moléculaires de leurs phénotypes divergents résident dans la structure des assemblages amyloïdes de la protéine, qui diffère entre ces pathologies. La bioactivité d’un amyloïde – sa capacité à recruter l’a-syn normale, induire son agrégation et propager la pathologie – constitue, au même titre que la structure, une propriété de souche. Cependant, les liens précis entre structure et bioactivité restent à établir.
De nombreuses études ont montré que les fibres dérivées d’échantillons MSA étaient plus bioactives que celles issues d’échantillons PD. Bien que ces études aient tenté de normaliser ou doser les amyloïdes, nous avons identifié de nombreux biais relatifs à leur identification et leur quantification, si bien que ces mesures de bioactivité pourraient traduire des différences de doses plutôt que de bioactivité spécifique – i.e. rapportée à la quantité d’amyloïdes. De plus, il existe une hétérogénéité des fibres au sein même de la MSA, mais les conséquences fonctionnelles de cette hétérogénéité restent à établir.
Dans ce but, notre étude s’est tout d’abord portée sur l’identification des biais méthodologiques, avant de mettre au point des procédures permettant une mesure non biaisée de la quantité d’a-syn amyloïde dans un échantillon biologique. Nous avons mis en place des méthodes de blot natifs (drop-blot et filter-blot), qui permettent d’évaluer la charge amyloïde relative dans les échantillons grâce à des immunomarquages avec des couples d’anticorps spécifiques que nous avons identifiés. De plus, certains ELISA commerciaux ne permettant pas la mesure des amyloïdes d’a-syn, en raison de l’utilisation d’anticorps non-adaptés, nous avons développé deux tests ELISA : un premier détectant toutes les espèces d’a-syn, et un deuxième quantifiant spécifiquement et de manière absolue les assemblages amyloïdes.
Grâce au développement de ces outils, nous avons pu quantifier précisément l’a-syn amyloïde présente dans des échantillons de cerveau de patients atteints de synucléinopathies, afin de déterminer leur bioactivité spécifique. Nous avons choisi d’utiliser comme modèle une lignée cellulaire rapportrice HEK-hSyn-YFP.
Ces études in vitro ont montré que les fibres contenues dans les cerveaux MSA sont plus bioactives que les fibres PD, à la fois en utilisant des échantillons de cerveaux bruts, ou des échantillons enrichis en amyloïdes suite à un fractionnement biochimique à partir de ces mêmes tissus cérébraux. De plus, et de façon remarquable, en étendant ces mesures à différentes régions cérébrales pour différents patients, nous avons pu mettre en évidence que la bioactivité des fibres MSA était distincte selon le patient dont elles étaient dérivées, mais que cette propriété était conservée dans les régions cérébrales d’un même patient. Ces données documentent l’existence de populations de sous-espèces d’amyloïdes d’a-syn au sein d’une même souche. Ceci corrobore des études ayant mis en évidence une diversité structurale des filaments MSA issus de différents patients. Nos travaux indiquent de plus l’absence d’une évolution structurale notable au cours de la progression de la pathologie cérébrale.
La caractérisation des agrégats générés in vitro permettra de déterminer si les propriétés de souche des amyloïdes cérébraux sont conservées lors de leur réplication.
Publications
Biases in α-synuclein immuno-quantitation: a core problem for basic and ancillary studies of Parkinson’s disease and multiple system atrophy.
Laferrière F, Sabatier L, Claverol S, De Giorgi F, Ichas F. Transl Neurodegener. 2024 Mar 25;13(1):15. doi: 10.1186/s40035-024-0040. PMID: 38528639
Jury
Dr. REZAEI Human, DR INRAE, Université Paris-Saclay Rapporteur
Dr. TORRENT Joan, CRHC INSERM, Université de Montpellier Rapporteur
Dr. LECOMTE Sophie, DR CNRS, Université de Bordeaux Examinatrice
Dr. EL MAMMERI Nadia, CR CNRS, Université de Bordeaux Examinatrice