Lieu : Centre Broca
Laetitia Bettarel
Équipe : Imagerie quantitative de la cellule (Sibarita)
IINS
Titre
Imagerie de super-résolution par localisation de molécules uniques en profondeur dans des modèles 3D multicellulaires à l’aide d’optique adaptative et de façonnage de PSF
Résumé
L’évaluation de l’organisation et de la dynamique des protéines dans leur contexte cellulaire natif
fournit des informations clés sur les mécanismes moléculaires qui gouvernent le fonctionnement
cellulaire. La microscopie de super-résolution fut une avancée majeure à cet égard, permettant
d’importantes découvertes en biologie cellulaire, développementale et en neurobiologie. Parmi ces
techniques, la microscopie de localisation de molécules uniques (SMLM) permet de localiser,
suivre et compter ces biomolécules dans leur environnement cellulaire avec une résolution
nanométrique. Cependant, l’imagerie SMLM conventionnelle est limitée par sa faible profondeur
de pénétration, empêchant ainsi l’étude de nombreux processus biologiques. Réaliser de la SMLM
en profondeur au sein d’échantillons multicellulaires complexes pose donc plusieurs défis : obtenir
un sectionnement optique efficace tout en conservant une bonne collection de photons, et corriger
les aberrations optiques introduites à la fois par le système et par l’échantillon, qui brouillent les
signaux des molécules uniques et compromettent la précision et la justesse de la localisation de
ces dernières.
Pour relever ces défis, nous avons développé au sein de l’équipe un microscope à feuille de
lumière, appelée soSPIM, qui permet l’imagerie en profondeur de molécules uniques. En parallèle,
l’optique adaptative (AO) est devenue une solution puissante pour corriger les aberrations induites
par le système et/ou l’échantillon et ainsi améliorer la qualité d’image en profondeur. Récemment,
nous avons combiné le soSPIM avec l’AO afin de réaliser de l’imagerie 3D SMLM en profondeur
à l’échelle de la cellule entière. Toutefois, cette implémentation repose encore sur des marqueurs
fiduciaires situés à proximité de l’échantillon, ce qui empêche la correction efficace des aberrations
induites par l’échantillon, qui sont particulièrement significatives dans les systèmes
multicellulaires. De plus, elle utilise des approches de localisation 3D conventionnelles, non
optimales pour une localisation rapide et précise de molécules uniques en profondeur.
Dans ce contexte, mes travaux de thèse se sont concentrés sur le développement de solutions
méthodologiques cherchant à étendre l’applicabilité de la plateforme d’imagerie AO-soSPIM à la
SMLM en profondeur dans des échantillons 3D complexes.
Dans un premier temps, j’ai développé un algorithme d’AO entièrement personnalisé en Python,
permettant un contrôle complet de tous les paramètres de la boucle de correction, y compris dans
le choix de métriques définies par l’utilisateur et spécifiquement adaptées à la modalité d’imagerie
et au type d’échantillon. À partir de cela, j’ai établi un cadre systématique pour évaluer des
métriques basées sur les images SMLM sans fiduciaires et d’identifier les plus sensibles et robustes
en profondeur.
Dans un second temps, j’ai exploré des méthodes de localisation de molécules uniques basés sur
l’apprentissage profond, exploitant des modèles de PSF issus des données afin d’améliorer à la
fois la robustesse de la localisation et la vitesse d’imagerie, offrant ainsi une alternative
prometteuse au fit gaussien conventionnel dans les ensembles de données SMLM 3D denses ou
complexes. J’ai également étudié des stratégies de modélisation expérimentale de la PSF pour
mieux prendre en compte les aberrations résiduelles et les déformations complexes de la PSF enii
profondeur. Ces approches, qui décrivent la PSF au-delà de l’approximation gaussienne, visent à
améliorer la précision et la justesse de localisation dans des conditions aberrantes.
Dans l’ensemble, ces développements méthodologiques établissent un pipeline robuste pour la
SMLM 3D corrigée au sein d’échantillons biologiques complexes. Ce travail élargit le champ
d’application de la microscopie super-résolutive vers des modèles 3D physiologiquement
pertinents tels que les sphéroïdes et les organoïdes.
Jury
– Rémi GALLAND : Directeur de thèse
– Laurent COGNET: Examinateur
– Alexandra FRAGOLA: Rapporteuse
– Lydia DANGLOT: Rapporteuse
– Jean-Baptiste SIBARITA: Invité