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David Perrais et al. dans Journal of Cell Biology

Des protéines fluorescentes vertes et rouges senseurs de pH pour étudier le trafic membranaire

Le 20 novembre 2014

pHuji, a pH-sensitive red fluorescent protein for imaging of exo- and endocytosis.
Shen Y, Rosendale M, Campbell RE, Perrais D.
J Cell Biol. 2014 Nov 10;207(3):419-32. doi: 10.1083/jcb.201404107.


Membrane trafficking at the plasma membrane, especially exocytosis (fusion of a vesicle with the plasma membrane) and endocytosis (formation of a vesicle from the plasma membrane), are fundamental processes in cells. In neurons they are involved in synaptic transmission, both at the pre- and post-synaptic levels. One of the most precise ways to study these processes in living cells is to express sensor proteins which detect the change in pH that occurs upon exocytosis between the inside of the vesicle and the extracellular space. The mutant of green fluorescent protein (GFP) called superecliptic phluorin (SEP) is ideally suited for this task, being virtually non-fluorescent at pH 5.5, the pH inside vesicles, and brightly fluorescent at the extracellular pH. SEP has been used for more than fifteen years to study exocytosis, and also to study endocytosis thanks to a protocol developed in 2005 by us and collaborators (see here and here)
The scientific community has been in search for many years of a red fluorescent protein with properties similar to SEP to follow the trafficking of two proteins at the same time. 



David Perrais and his PhD student Morgane Rosendale
have identified, in collaboration with the group of Robert Campbell (University of Alberta, Canada), a specialist in making fluorescent protein sensors, a protein derived from the red fluorescent mApple which we have named pHuji (named after Fuji, the cultivar of apple). pHuji has the required properties for detecting individual exo- and endocytosis events. We could show for example the internalisation of two receptors in single endocytic vesicles (see Figure). With this new tool in hand, we will be able to further expand the range of possible experiments to study these fundamental processes of cell physiology. (below , zoomable picture)





Résumé
Le trafic membranaire à la membrane plasmique, en particulier l’exocytose (fusion d’une vésicule avec la membrane plasmique) et l’endocytose (formation d’une vésicule à partir de la membrane plasmique) sont des processus cellulaires fondamentaux. Dans les neurones ils sont impliqués dans la transmission synaptique, des côtés tant présynaptiques que post-synaptiques. Un des moyens les plus précis d’étudier ces processus dans les cellules vivantes est d’exprimer des senseurs protéiques qui détectent le changement de pH qui se produit lors de l’exocytose. La protéine dérivée de la GFP appelée superecliptic phluorin (SEP) est idéalement adaptée à cette tâche car elle est virtuellement non fluorescente à pH 5.5, le pH à l’intérieur des vésicules, et fortement fluorescente au pH extracellulaire.

La SEP a été utilisée depuis plus de quinze ans pour étudier l’exocytose, et également l’endocytose grâce à un protocole développé par nous et des collaborateurs en 2005 (voir ici et ici). Durant de nombreuses années, la communauté scientifique a recherché une protéine fluorescente rouge ayant les mêmes propriétés que la SEP pour suivre le trafic de deux protéines simultanément.

David Perrais et son étudiante en thèse Morgane Rosendale ont identifié, en collaboration avec le groupe de Robert Campbell (Université d’Alberta, Canada), un spécialiste dans le développement de nouveaux senseurs protéiques, une protéine dérivée de la protéine fluorescente rouge mApple que nous avons nommée pHuji (d’après Fuji, une variété de pommes). pHuji a les propriétés requises pour permettre la détection d’événements individuels d’exo- et d’endocytose. Par exemple, nous avons pu montrer l’internalisation de deux récepteurs dans une même vésicule (voir Figure). Grâce à ce nouvel outil à disposition, nous serons capables d’étendre la gamme des expériences possibles pour étudier ces phénomènes fondamentaux de la biologie des cellules.

David Perrais / IINS (david.perrais @ u-bordeaux2.fr)
Dernière mise à jour le 21.11.2014

PhD student



Morgane Rosendale
PhD student

Institut interdisciplinaire de Neurosciences
CNRS UMR 5297
Equipe: Dynamic Organization and Function of Synapses
Team leader: Daniel Choquet 


Morgane Rosendale est soutenue par le LabEx pour terminer ses travaux de thèse. (bourse de soudure)