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Thèse Adel Kechkar

Méthodes de reconstruction et de quantification pour la microscopie de super-résolution par localisation de molécules individuelles

Le 20 décembre 2013

Vendredi 20 Dec,  CGFB , directeur de thèse Jean Baptiste Sibarita, IINS


Le domaine de la microscopie de fluorescence a connu une réelle révolution ces dernières années, permettant d'atteindre des résolutions nanométriques,
bien en dessous de la limite de diffraction prédite par Abbe il y a plus d’un siècle. Les techniques basées sur la localisation de molécules individuelles telles que le PALM (Photo-Activation Light Microscopy) ou le (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) permettent la reconstruction d’images d’échantillons biologiques en 2 et 3 dimensions, avec des résolutions quasi-moléculaires. Néanmoins, même si ces techniques nécessitent une instrumentation relativement simple, elles requièrent des traitements informatiques conséquents, limitant leur utilisation en routine. En effet, plusieurs dizaines de milliers d’images brutes contenant plus d’un million de molécules doivent être acquises et analysées pour reconstruire une seule image. La plupart des outils disponibles nécessitent une analyse post-acquisition, alourdissant considérablement le processus d’acquisition. Par ailleurs la quantification de l’organisation, de la dynamique mais aussi de la stœchiométrie des complexes moléculaires à des échelles nanométriques peut constituer une clé déterminante pour élucider l’origine de certaines maladies.

Ces nouvelles techniques offrent de telles capacités, mais les méthodes d’analyse pour y parvenir restent à développer. Afin d’accompagner cette nouvelle vague de microscopie de localisation et de la rendre utilisable en routine par des expérimentateurs non experts, il est primordial de développer des méthodes de localisation et d’analyse efficaces, simples d’emploi et quantitatives. Dans le cadre de ce travail de thèse, nous avons développé dans un premier temps une nouvelle technique de localisation et reconstruction en temps réel basée sur la décomposition en ondelettes et l‘utilisation des cartes GPU pour la microscopie de super-résolution en 2 et 3 dimensions. Dans un second temps, nous avons mis au point une méthode quantitative basée sur la visualisation et la photophysique des fluorophores organiques pour la mesure de la stœchiométrie des récepteurs AMPA dans les synapses à l’échelle nanométrique.
Mots clefs : Microscopie de super-résolution, localisation de molécules individuelles, traitement temps-réel, décomposition en ondelettes, GPU, photophysique de fluorophores, récepteurs post-synaptiques.

 

Reconstruction and quantification methods for single-molecule based super-resolution microscopy

The field of fluorescence microscopy has witnessed a real revolution these last few years, allowing nanometric spatial resolutions, well below the diffraction limit predicted by Abe more than a century ago. Single molecule-based super-resolution techniques such as PALM (Photo-Activation Light Microscopy) or (d)STORM (direct Stochastic Optical Reconstruction Microscopy) allow the image reconstruction of biological samples in 2 and 3 dimensions, with close to molecular resolution. However, while they require a quite straightforward instrumentation, they need heavy computation, limiting their use in routine. In practice, few tens of thousands of raw images with more than one million molecules must be acquired and analyzed to reconstruct a single super-resolution image. Most of the available tools require post-acquisition processing, making the acquisition protocol much heavier. In addition, the quantification of the organization, dynamics but also the stoichiometry of biomolecular complexes at nanometer scales can be a key determinant to elucidate the origin of certain diseases. Novel localization microscopy techniques offer such capabilities, but dedicated analysis methods still have to be developed.

In order to democratize this new generation of localization microscopy techniques and make them usable in routine by non-experts, it is essential to develop simple and easy to use localization and quantitative analysis methods. During this PhD thesis, we first developed a new technique for real-time localization and reconstruction based on wavelet decomposition and the use of GPU cards for super-resolution microscopy in 2 and 3 dimensions. Second, we have proposed a quantitative method based on the visualization and the photophysics of organic fluorophores for measuring the stoichiometry of AMPA receptors in synapses at the molecular scale.

Key words: Super-resolution microscopy, single-molecule localization, real-time processing, wavelet decomposition, GPU, fluorophore photophysics, post-synaptic receptors.

 


Publications
- Izeddin I, Boulanger J, Racine V, Specht CG, Kechkar A, et al. (2012) Wavelet analysis for single molecule localization microscopy. Opt Express 20: 2081-2095.

- Kechkar A, Nair D, Heilemann M, Choquet D, Sibarita J-B (2013) Real-Time Analysis and Visualization for Single-Molecule Based Super-Resolution Microscopy. PLoS ONE 8(4): e62918. doi:10.1371/journal.pone.0062918

- Patent & Industrial Technology Transfer to Molecular Devices (Kechkar & Sibarita, Univ. Bordeaux 2/CNRS) (2012)


Jury

NÄGERL Valentin PU Université Bordeaux
Président du jury
KERVRANN Charles DR INRIA
Rapporteur
SALAMERO Jean DR CNRS
Rapporteur
ZIMMER Christophe
Chef de laboratoire Institut Pasteur
Examinateur
SIBARITA Jean-Baptiste IR CNRS
Directeur de thèse

Directeur de thèse



Jean Baptiste Sibarita
Ingénieur de recherche 
CNRS 
Responsable de l'équipe: Imagerie quantitative de la cellule.
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