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Thèse Margot Tertrais

Exploration du rôle des différents domaines C2 de l'otoferline et des isoformes des canaux calciques CaV1.3 dans la transmission synaptique des cellules ciliées auditives

Le 19 décembre 2018

Soutenance le 19 décembre 2019 à 14h , Amphi Broca Nouvelle Aquitaine. Directeur de thèse : Didier Dulon, Directeur de recherche INSERM, Université de BordeauxLaboratoire de Neurophysiologie de la Synapse Auditive INSERM U1120 


 L'encodage du signal acoustique en impulsions nerveuses se réalise au niveau des synapses à ruban des cellules ciliées internes (CCI) de la cochlée.
 Une dépolarisation déclenche l'exocytose des vésicules synaptiques suite à l'activation des canaux calciques CaV1.3 et à l'action d'un senseur calcique particulier, l'otoferline, une grande protéine se composant d'un domaine transmembranaire en C-terminal et de six domaines C2 (A-F) pouvant lier le Ca2+ et les phospholipides. Afin de caractériser le rôle de ces différents domaines C2, nous avons utilisé des vecteurs viraux (AAV) permettant l'expression de formes raccourcies de l'otoferline (mini-Otof) in vivo dans les CCI de souris dépourvues d'otoferline (Otof -/-). 
Nous montrons que les mini-Otof contenant les domaines C2-EF, C2-DEF ou C2-ACEF sont suffisantes pour restaurer l'exocytose rapide des CCI Otof -/-, sans toutefois restaurer l'audition car le recrutement des vésicules synaptiques reste altéré. Nous révélons pour la première fois la présence d'une endocytose ultra-rapide (τ < 20 ms) dynamine- et otoferline dépendante, une fonction certainement essentielle à l'homéostasie membranaire des CCI. L'expression des mini-Otof C2-DEF a également permis de restaurer partiellement la composante rapide de l'inactivation du courant calcique des CCI, celle-ci étant absente chez les souris Otof -/-.
Cette inactivation rapide est réalisée par les isoformes courtes Cav1.3S qui ont leur partie C-terminale régulatrice tronquée, contrairement aux isoformes longues Cav1.3L dépourvues d'inactivation. 

Afin de différencier les rôles spécifiques de ces isoformes dans le cycle des vésicules synaptiques, nous avons utilisé la technologie CRISPR-Cas9, nous permettant d'éditer spécifiquement la partie C-terminale régulatrice des canaux Cav1.3L. Nos résultats montrent que les souris CRISPR-Cav1.3L présentent une surdité sévère expliquée au niveau des CCI par un défaut de recrutement vésiculaire aux zones actives, alors que les Cav1.3S inaltérés contrôlent la fusion rapide des vésicules synaptiques.

 

Exploring the role of the various C2 domains of otoferlin and isoforms of calcium channels CaV1.3 in synaptic transmission of auditory hair cells

The precise encoding of acoustic signals into nerve impulses is achieved at the ribbon synapses of inner hair cells (IHC) of the cochlea. Exocytosis of synaptic vesicles by IHC is triggered by voltage-activation of Cav1.3 calcium channels and the action of a specific calcium sensor, otoferlin, a large protein with a single C-terminal transmembrane domain and six C2 (A-F) domains which binds Ca2+ and interacts with phospholipids. 

In order to characterize the function of the various otoferlin C2 domains, we used viral vectors (AAV) allowing the expression of shortened forms of otoferlin (mini-Otof), in vivo, in IHC from mice lacking otoferlin (Otof -/-). We show that mini-Otof containing C2-EF, C2-DEF or C2-ACEF domains are sufficient to restore fast synaptic vesicle exocytosis in Otof -/- IHC, but without restoring hearing because vesicular replenishment remains impaired. For the first time, we also uncover an ultra-fast endocytosis (τ < 20 ms) dynamin- and otoferlin-dependant, a function that is certainly essential for a fast regulation of IHC membrane homeostasis. 
Furthermore, the expression of the mini-Otof C2-DEF also partially restored the fast component of the Ca2+ current inactivation in Otof -/- IHC. This rapid inactivation is carried out by Cav1.3S short isoforms which have a truncated C-terminal regulatory domain, unlike Cav1.3L long isoforms which display no inactivation. 

To characterize the specific role of these Cav1.3 isoforms, we used CRISPR-Cas9 technology, allowing a specific removal of the C-terminal regulatory part of the Cav1.3L channels in IHC. Our results show that CRSIPR- Cav1.3L mice display severe deafness explained at the IHC level by a defect in vesicular replenishment of the active zones, while Cav1.3S are sufficient to ensure fast and transient exocytosis of docked synaptic vesicles.

Publications
Tertrais M, Bouleau Y, Emptoz A, Belleudy S, Sutton RB, Petit C, Safieddine S and Dulon D (2018) Viral transfer of mini-otoferlins partially restores the fast component of exocytosis and uncovers ultrafast endocytosis in auditory hair cells of otoferlin knock-out mice. Journal of Neuroscience (sous presse)

Tertrais M, Bouleau Y, Leclère JC, Peineau T and Dulon D (2018). The use of CRISPR-Cas9 genome editing in vivo to probe the role of Cav1.3 Ca2+ channel isoforms in synaptic transmission of mouse auditory hair cells. (mansucrit en préparation)

Michalski N, Goutman JD, Auclair SM, Boutet de Monvel J, Tertrais M, Emptoz A, Parrin A, Nouaille S, Guillon M, Sachse M, Ciric D, Bahloul A, Hardelin JP, Sutton RB, Avan P, Krishnakumar SS, Rothman JE, Dulon D, Safieddine S and Petit C (2017). Otoferlin acts as a Ca2+ sensor for vesicle fusion and vesicle pool replenishment at auditory hair cell ribbon synapses. eLife 6: e31013.

Dulon D, Papal S, Patni P, Cortese M, Vincent PF, Tertrais M, Emptoz A, Tlili A, Bouleau Y, Michel V, Delmaghani S, Aghaie A, Pepermans E, Alegria-Prevot O, Akil O, Lustig L, Avan P, Safieddine S, Petit C, El-Amraoui A. (2018) Clarin-1 gene transfer rescues auditory synaptopathy in model of Usher syndrome. J Clin Invest 1;128(8):3382-3401

Vincent PF, Cho S, Tertrais M, Bouleau Y, von Gersdorff H and Dulon D (2018) Clustered Ca2+ channels are blocked by synaptic vesicle proton release at mammalian auditory ribbon synapses. Cell Reports in press, Sneak Peek, https://ssrn.com/abstract=3257348

 

 

Jury

Président :
Vincent Darrouzet, PU, CHU, Bordeaux 
Rapporteur : 
Gwenaëlle Géléoc,
Professeur, Ecole de Médecine de Harvard, USA 
Rapporteur : 
Brigitte Malgrange, 
PU de Liège, Belgique 
Examinateur : 
Mireille Montcouquiol, 
DR INSERM, Université de Bordeaux 
Examinateur : 
Marc Bartoli,
DR CNRS, Université Aix-Marseille 
Directeur de Thèse : 
Didier Dulon
DR INSERM, Université de Bordeaux