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Thèse Anaël Chazeau

"Rôle de l'organisation du cytosquelette d'actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique des épines dendritiques"

Le 4 décembre 2012

Les épines dendritiques sont de petites protrusions post-synaptiques présentant des changements morphologiques corrélés avec la plasticité synaptique. Elles ont pour origine les filopodes dendritiques qui s'élargissent lors du contact avec l'axone. Ces changements morphologiques impliquent une grande variété de molécules dont des protéines associées à l'actine et des protéines d'adhésion. Cependant, comment ces différentes protéines sont coordonnées dans le temps et l'espace est encore largement méconnu. De plus, les techniques de microscopie conventionnelle ne permettent pas d'étudier l'organisation et la dynamique de ces protéines dans les épines dont la taille est proche de la limite de resolution. L'objectif de ma thèse a donc été d'explorer le rôle des protéines associées à l'actine ainsi que celui des protéines d'adhésion N-cadhérines dans l'organisation et la dynamique du cytosquelette d'actine des épines dendritiques.
Dans une première étude, nous avons suivi la motilité des filopodes et épines dendritiques de neurones en visualisant l'actine-GFP. Nous avons couplé cette approche avec : 1) une technique de piégeage optique de microsphères recouvertes de N-cadhérines ou des substrats micro-imprimés également recouverts de N-cadhérines afin de contrôler temporellement et spatialement les adhésions cadhérine-cadhérine, 2) la stimulation pharmacologique de la myosine II afin d'induire la contraction F-actine/myosine et 3) l'expression de mutants de N-cadhérine non adhésifs. Nous avons ainsi démontré que la stabilisation des filopodes en épines était dépendante de l'engagement d'un embrayage moléculaire entre les adhésions trans-synaptiques N-cadhérine et le flux rétrograde d'actine généré par les myosines II.
Dans une deuxième étude, nous avons utilisé la microscopie super-résolutive (PALM et dSTORM) et le suivi de protéines individuelles (sptPALM) pour étudier l'organisation et la dynamique à l'échelle nanométrique des protéines à l'origine des réseaux d'actine branchés dans les épines. Ainsi, nous avons caractérisé la localisation et la dynamique de l'actine, du complexe Arp2/3, du complexe WAVE, d'IRSp53, de VASP et de Rac-1. Nous avons montré que, contrairement aux structures motiles classiques comme lamellipode, le réseau d'actine branché dans les épines n'ést pas formé aux extrémités protrusives puis incorporé dans un flux rétrograde d'actine. Ce réseau est initié à la PSD puis croît vers l'extérieur afin de générer les protrusions membranaires responsablent des changements morphologiques de l'épine. Nos résultats montrent également qu'un contrôle strict de l'activité de Rac-1 est nécessaire au maintien de la morphologie des épines dendritiques et de l'architecture du réseau d'actine branché.
L'ensemble de mon travail souligne l'importance du rôle de l'organisation à l'échelle nanométrique du réseau d'actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique et la formation des épines dendritiques. Ces résultats pourraient avoir un rôle important dans la compréhension des changements morphologiques lors de la plasticité synaptique.


Mots clés: épines dendritiques, protéines régulatrices de l'actine, N-cadherine, PSD, microscopie super-résolutive, suivi de protéines individuelles.

 

"Role of branched actin network organization and N-cadherin adhesion in dendritic spine dynamics"

Dendritic spines are tiny post-synaptic protrusions exhibiting changes in morphology correlated with synaptic plasticity. They originate from motile dendritic filopodia, which enlarge after contacting axons. These morphological changes involve a wide number of molecular actors, including actin-binding proteins, and adhesion molecules. However, how these various molecular components are coordinated temporally and spatially to tune changes in spine shape remains unclear. Furthermore, conventional photonic microscopy techniques could not achieved the spatial resolution required to study the dynamic nanoscale organization of these proteins within the micron size dendritic spines. The objective of my Ph.D. was to unravel how actin-binding proteins and N-cadherin adhesion regulate the organization and dynamics of F-actin network in dendritic spines.
In a first study, we measured the motility of dendritic filopodia and spines by time lapse imaging of actin-GFP in primary hippocampal neurons. We combined those measurements with: 1) manipulation of N-cadherin coated beads with optical tweezers, or micropatterns to control the timing and location of nascent N-cadherin adhesions, 2) pharmacological stimulation of myosin II to trigger contraction of the F-actin/myosin network and 3) expression of non-adhesive N-cadherin mutants to compete for the interaction between N-cadherin adhesion and F-actin. Using these different approaches we demonstrated that the stabilization of dendritic filopodia into mature spines was dependent on the engagement of a molecular clutch between trans-synaptic N-cadherin adhesions and the myosin driven F-actin flow.
In a second study, we used super resolution microscopy (PALM and dSTORM) and single protein tracking (sptPALM) to study the dynamic nanoscale organizations of branched actin networks within dendritic spines. Using these technics, we characterized within dendritic spines, the localization and dynamics of actin, Arp2/3 complex, WAVE complex, IRSp53, VASP and Rac-1. We established that, opposite to classical motile structures such as the lamellipodium, branched F-actin networks in dendritic spines are not formed at the tip of membrane protrusions and incorporated in a retrograde flow. On the contrary, they are growing outwards from the PSD generating membrane protrusions responsible for spine motility. We also show that a thigh control of Rac1 activity is required to maintain dendritic spine morphology and branched actin network organization.
Altogether, these studies point out the role of the nanoscale functional organization of F-actin networks and its linkage to adhesion proteins in the regulation of dendritic spine formation and dynamics. These findings may have important implications in the understanding of spine morphology changes driven by synaptic activity.


Key words: dendritic spine, actin-binding proteins, N-cadherin, PSD, super resolution microscopy and single protein tracking.

mailto:anael_chazeau@hotmail.com
Dernière mise à jour le 01.07.2013

Focus

Anaël Chazeau
PhD student. Equipe de Olivier Thoumine :Biophysique de l'adhésion et du cytosquelette
(IINS) UMR 5297 CNRS/Université Bordeaux2. Centre de Génomique Fonctionnelle


Anaël Chazeau a préparé sa thèse sous la direction de Grégory Giannone. Il présentera :"Rôle de l'organisation du cytosquelette d'actine branché et des adhésions N-cadhérine dans la dynamique des épines dendritiques". CGFB 14h30


Jury

Nägerl Valentin PU Bordeaux Président du jury
Muller Dominique PU (Univ. de Genève) Rapporteur
Mège René-Marc DR (CNRS) Rapporteur
Gautreau Alexis DR (CNRS) Examinateur
Dahan Maxime DR (CNRS) Examinateur
Thoumine Olivier DR (CNRS) Membre invité
Giannone Grégory CR (CNRS) Directeur de thèse