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Thèse Amandine Berthet

Relations entre les dyskinésies L-dopa induites et le récepteur D1 de la dopamine dans les neurones striataux : Etude expérimentale et perspectives en thérapeutique

Le 30 novembre 2010

Résumé

Mes travaux de thèse concernent le rôle du récepteur D1 de la dopamine dans les dyskinésies L-dopa induites, effets secondaires extrêmement handicapants du traitement de la maladie de Parkinson. En condition de dénervation striatale mimant l'environnement de la maladie de Parkinson, le traitement chronique par la L-dopa entraine des altérations majeures du trafic intraneuronal et de la signalisation du récepteur D1 de la dopamine dans les principaux neurones cibles de la dopamine, les neurones épineux de taille moyenne du striatum. Il existe en particulier une hypersensibilisation des récepteurs D1 dans les neurones striataux, avec une abondance accrue à la membrane plasmique et une diminution du niveau d'expression de la protéine GRK6 (Protéine kinase des Récepteurs Couplés aux Protéines G 6), un des acteurs clefs des phénomènes de désensibilisation, en relation directe avec l'apparition des dyskinésies.
C'est dans ce contexte que se situe mon travail de thèse qui a eu pour objectif de mettre à profit et/ou de développer différents modèles expérimentaux et outils « in vivo » et « in vitro ». Nous avons associé des techniques d'imagerie cellulaire et tissulaire à des approches comportementales, afin d'explorer certains des événements cellulaires et moléculaires à l'échelle du neurone striatal et des réseaux neuronaux, reliant le niveau d'expression du récepteur D1, sa compartimentation cellulaire, son trafic intraneuronal et les dyskinésies ou des conditions pharmacologiques équivalentes.
Nous avons confirmé dans le modèle du rat lésé unilatéralement à la 6-OHDA, traité par la L-dopa et développant des mouvements anormaux analogues aux dyskinésies chez l'homme, que le récepteur D1 est anormalement abondant à la membrane plasmique des neurones du striatum, alors qu'il devrait être internalisé après stimulation par son ligand naturel, la dopamine. Nous avons mis en évidence que les mécanismes d'internalisation après stimulation par un agoniste restent néanmoins fonctionnels. Après administration de l'agoniste D1, chez les animaux dyskinétiques, l'abondance des récepteurs D1 augmente dans les compartiments notamment impliqués dans les mécanismes d'internalisation et de transport (vésicules) et de dégradation (corps multivésiculaires). Nous avons apporté une explication possible à cette abondance anormale et à ce défaut d'internalisation, en montrant qu'ils pourraient être dus à une hétérodimérisation entre les récepteurs D1 et D3. La co-activation des récepteurs D1 et D3 par la L-dopa favoriserait l'ancrage du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux.
Dans ce cadre, l'abord de l'étude de l'implication du protéasome dans la régulation de l'expression du récepteur D1 de la dopamine nous a semblé particulièrement important, sur la base des premières études soulignant l'implication de ce système catalytique dans le contrôle de l'activité et du métabolisme des récepteurs aux neurotransmetteurs. Nous avons révélé pour la première fois des liens entre l'activité catalytique du protéasome et la dynamique intraneuronale du récepteur D1 et plus particulièrement nous avons montré que son activité chymotrypsine-like est réduite de façon spécifique dans le striatum d'animaux dyskinétiques, comme une conséquence directe d'une déplétion en dopamine associée à une hyperstimulation dopaminergique.
Nous avons testé en situation expérimentale une stratégie « thérapeutique » nouvelle en restaurant le mécanisme de désensibilisation homologue du récepteur D1 de la dopamine, par correction du déficit de la kinase GRK6 par transfert du gène correspondant via l'injection intrastriatale d'un vecteur lentiviral. Nous avons montré que cette approche permet de réduire considérablement la sévérité des dyskinésies dans les modèles rat et primate non-humain, analogues des dyskinésies chez l'homme et qu'elle restaure les effets thérapeutiques de la L-dopa. Ces effets sont la conséquence de la restauration des mécanismes de désensibilisation homologue : la surexpression de GRK6 entraîne l'internalisation spécifique des récepteurs D1.
L'ensemble de nos résultats s'inscrit dans une démarche de recherche translationnelle menée depuis plusieurs années au laboratoire allant de la cellule au patient, avec pour but de transposer la compréhension des données expérimentales concernant les anomalies de l'expression du récepteur D1 de la dopamine en stratégies thérapeutiques dans les dyskinésies L-dopa induites. Nos investigations montrent qu'il est possible d'agir sur l'expression du récepteur D1 à la membrane plasmique des neurones striataux de manière indirecte, en manipulant trois co-activateurs de son métabolisme, pour espérer réduire « in fine » la sévérité des dyskinésies.

Mots clés: Dyskinésies L-dopa induites ; Neurones épineux de taille moyenne du striatum ; Récepteur D1 de la dopamine ; Récepteur D3 de la dopamine ; Désensibilisation homologue ; GRK6 ; Protéasome.
          

Abstract

In my thesis work, I studied the role of dopamine D1 receptor in L-dopa induced dyskinesia, a debilitating complication of Parkinson's disease's treatment. In condition of striatal denervation, that mimics the Parkinson's disease environment, chronic treatment with L-dopa leads to major alterations of intraneuronal trafficking and dopamine D1 receptor signaling in the major target of dopamine neurons, the striatal medium spiny neurons. In particularly, there is a D1 receptor hypersensitivity in striatal neurons, with an increased abundance of D1 receptor at the plasma membrane and a decreased level of GRK6 protein expression, a key actor in desensitization mechanism, directly related with the apparition of dyskinesia.
In this context, I used different in vitro and in vivo experimental models and tools. I have associated cell and tissue imaging techniques and behavioural approaches in order to explore cellular and molecular events in striatal neuron and neuronal networks, linking the D1 receptor expression level, its cellular compartmentalization, its intraneuronal trafficking and the dyskinesia behaviour or equivalent pharmacological conditions.
We confirmed in the rat analog of L-dopa-induced dyskinesia, i.e., the L-dopa-induced abnormal involuntary movements in unilaterally 6-hydroxydopamine (6-OHDA)-lesioned animals, that D1 receptor is abnormally abundant in the plasma membrane of neurons in the striatum, whereas it should be internalized after stimulation by its natural ligand, the dopamine. We showed that nevertheless the internalization mechanisms after agonist stimulation remains functional. After D1 agonist administration in dyskinetic animals, D1 receptor abundance increases in the cytoplasmic compartments involved in the internalization and transport (vesicles) and degradation (multivesicular bodies) mechanisms. Based on D3 receptor antagonist experiment, we propose that this abnormal abundance and this lack of internalization could be due to heterodimerization between the D1 and D3 receptors. D1 and D3 receptors co-activation by L-dopa might anchor D1 receptor at the plasma membrane of striatal neurons.
In this context, analysis of proteasome involvement in the regulation of dopamine D1 receptor expression seemed particularly important, on the basis of the first studies underlying proteasome involvement in the activity and metabolism of neurotransmitter receptors. We demonstrated for the first time links between the proteasomal catalytic activity and D1 receptor intraneuronal dynamics and more particularly we showed that the proteasome chymotrypsin-like activity is reduced specifically in the striatum of dyskinetic animals, as a direct consequence of dopamine depletion associated with dopaminergic hyperstimulation.
We tested in experimental condition, a new "therapeutic"strategy in order to restore the dopamine D1 receptor homologous desensitization mechanism, correcting the GRK6 kinase deficit by gene transfer through the intrastriatal injection of a lentiviral vector. We showed that this approach reduces significantly the dyskinesia severity in rat and non-human primate models and restores the L-dopa therapeutic effects. These effects are a consequence of the homologous desensitization mechanisms restoration : indeed GRK6 overexpression provokes specific D1 receptor internalization.
Our results are part of a translational research conducted over several years in the laboratory from cell to patient, in order to translate our increased understanding of D1 receptor function abnormalities into therapeutic strategies for L-dopa induced dyskinesia. Our investigations show that it is possible to act on D1 receptor expression at the plasma membrane of striatal neurons via various routes, all resulting into diminished dyskinesia severity.

Keywords: L-dopa induced dyskinesia; medium spiny neurons in the striatum, D1 dopamine receptor, D3 dopamine receptor, homologous desensitization, GRK6; Proteasome.


Lieu: Institut François Magendie
Equipe INB

Mention Sciences Biologiques et Médicales

Option Neurosciences

Adresse du laboratoire
CNRS 5091 Université Bordeaux 2 Institut François Magendie 146 rue Léo Saignat 33077 Bordeaux cédex


Focus



Amandine Berthet a préparé sa thèse sous la direction de Bertrand Bloch dans l'équipe "Physiopathologie des syndromes parkinsoniens" .

Jury

Stéphane Oliet DR CNRS Président
Bruno Giros DR CNRS Rapporteur
André Nieoullon PU Rapporteur
Peter Vanhoutte CR CNRSExaminateur
Isabelle Sagot CR CNRS Examinateur
Laurent Groc CR CNRS Membre invité
Bertrand Bloch PU-PH Directeur de thèse

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