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Thèse Boris Decourt

Recherche de molécules impliquées dans l'inhibition de la régénération axonale dans le colliculus inférieur .

Le 15 décembre 2004

Résumé

Au cours du développement, les neurones du système nerveux central des mammifères perdent leur capacité à régénérer des axones lésés. Ainsi, des cultures organotypiques de colliculus inférieur prélevées sur des animaux âgés de 6 jours (P6) et dont la région médiane (commissure) a été sectionnée montrent une régénération robuste des fibres commissurales vers le lobe controlatéral. A l’inverse, le même protocole appliqué sur des cultures issues d’animaux au stade P10-12 n’est suivi d’aucune repousse de fibres à travers le site de lésion. Le but de cette étude était de rechercher des molécules exprimées dans le colliculus inférieur au stade P10-12 qui pourraient jouer un rôle dans l’inhibition de la régénération axonale.
Dans un premier temps, une hybridation soustractive suppressive a été réalisée sur le colliculus inférieur de souris afin d’obtenir des molécules spécifiquement exprimées ou sur- exprimées au stade P10 et au stade P6. Cent clones de P6 et 200 clones de P10 ont été séquencés et comparés aux séquences disponibles dans les banques de séquences informatiques (déposés dans Genbank en tant qu’EST avec les numéros d’accès de CF800480 à CF800732). Afin d’éliminer les "faux-positifs", un criblage par dot-blot a été réalisé. Les gènes du métabolisme et mitochondriaux ont été écartés de l’étude. Finalement, six clones ont été sélectionnés et une analyse détaillée de leur expression dans le cerveau, et en particulier dans le colliculus inférieur, a été réalisée. Parmi ces clones, quatre correspondent à des molécules connues (neuroleukine, calmoduline 1, cortactine et Rho-7) mais leur implication potentielle dans le processus de repousse axonale n’a pas encore été étudiée, et deux correspondent à de nouvelles protéines (A11 et SSTM [Short Seven Trans-Membrane protein]).

La distribution des ARN messagers de la neuroleukine, de la calmoduline, de la cortactine et de Rho-7 par hybridation in situ a révélé une expression importante dans l’ensemble des neurones du cerveau adulte. De plus, une augmentation du taux d’expression de ces messagers a été observée entre les stades P0 et adulte dans les diverses régions cérébrales, et notamment dans le colliculus inférieur.

La distribution des protéines correspondantes a été étudiée par immunohisto-chimie au cours du développement et au stade adulte. La localisation de la cortactine et de Rho-7 a été réalisée ici pour la première fois in vivo dans le cerveau. La cortactine a été observée dans la région intracellulaire juxta-membranaire des différents compartiments des neurones (soma, dendrites et axones). A l’inverse, Rho-7 est largement présente dans les axones ainsi que dans les prolongements des cellules gliales de Bergman du cervelet.
L’analyse bioinformatique de A11 a révélé une identité de 98 % avec l’otospiraline de souris, qui a été décrite comme étant uniquement exprimée par la cochlée et dont la fonction est inconnue. La protéine prédite a un poids moléculaire de 10 kDa. Elle présente un segment trans-membranaire et un site potentiel de glycosylation. Le messager de A11 a été identifié dans la majorité des neurones et des astrocytes du cerveau. L’analyse par western blot a révélé deux bandes : une de 17 kDa, suggérant une glycosylation, et une à 35 kDa laissant supposer une multimérisation. La protéine est localisée au niveau des membranes cytoplasmiques des neurones et des astrocytes dans le cerveau. L’observation en microscopie électronique a révélé une distribution à la fois au niveau post-synaptique et dans des prolongements de type astrocytaires.
L’étude bioinformatique de SSTM a montré que cette molécule présente un ARN messager de 809 paires de bases. La prédiction de la protéine a donné un poids moléculaire de 27 kDa pour 238 acides aminés. De plus, la prédiction de la structure secondaire a révélé une possible localisation membranaire, avec 7 segments trans-membranaires, sans aucune ressemblance avec les récepteurs couplés aux protéines G (ou GPCRs). Le messager de SSTM est exprimé par la majorité des neurones du cerveau, mais aussi par les astrocytes. De plus, le taux d’expression de l’ARNm augmente dans le cerveau au cours du développement, et notamment dans le colliculus inférieur. Après avoir synthétisé un anticorps contre SSTM, l’étude par western blot a révélé sa présence dans différents organes (cerveau, foie, rein, cœur, poumons, testicule, cochlée). La taille observée par western blot correspond au double du poids du monomère, suggérant là encore une multimérisation de cette protéine. La distribution de la protéine dans le cerveau adulte a confirmé la localisation au niveau de la membrane cytoplasmique, avec un important marquage neuronal. La localisation subcellulaire a révélé une présence pré- et post-synaptique, et au niveau de prolongements de type astrocytaires.
Les protéines A11 et SSTM sont sur-exprimées par les astrocytes suite à une lésion cérébrale.

En conclusion, l’hybridation soustractive nous a permis d’isoler des molécules dont le rôle potentiel dans la repousse axonale n’a pas été étudié, ainsi que des molécules de fonction inconnue. L’analyse de l’expression des six molécules retenues dans le cerveau au cours du développement et/ou après lésion suggère que la neuroleukine, la cortactine, Rho-7, A11 et SSTM pourraient être impliquées dans le processus de la régénération axonale. Une approche physiologique est en cours pour rechercher la fonction de A11 et SSTM, notamment en utilisant des techniques de siRNA et d’interactions protéiques.

jury

Président du jury : Jean-Marie CABELGUEN, Physiopathologie des réseaux neuronaux médullaires INSERM EMI 358, Bordeaux
Rapporteur 1 : Christine PETIT, Unité de Génétique des Déficits Sensoriels, INSERM U587, Institut Pasteur, Paris
Rapporteur 2 : Alain PRIVAT, Physiopathologie et thérapie des déficits sensoriels et moteurs INSERM Unité 583, Montpellier
Directeur du laboratoire : Didier DULON, Laboratoire de Biologie Cellulaire de Moléculaire de l'Audition, EA 3665, Bordeaux
Directeur de thèse : Aziz HAFIDI